去年下半年做了一段時間WB實驗,前田再次做,只換了個一抗和細胞裂解液,其他都沒變(當然目的蛋白也不同了)。去年能出條帶,這次卻不能了。。。
現將改變的試劑及可疑操作羅列如下,供大神分析并搭救
1.細胞裂解液:RAPI細胞裂解液(強),碧云天生物技術研究所;
2.一抗:Isotype, IgG;    Host, Rabbit;     Species Reactivity, Human, Rat。  二抗:Goat Anti-Rabbit IgG.
3.目的蛋白大小約21KD,內參用GAPDH,于27KD-18KD處剪膜。一抗用5%BSA1:1500稀釋,37oC孵育90min;二抗用5%BSA1:3000稀釋,37oC孵育90min。
4.DAB顯色試劑盒顯色。PVDF膜的熊樣如下:A

今天做了點蛋白試驗(有叫“點雜交”),膜泡甲醇,晾干;蛋白樣品(4個)按20ug/10ul加2xLoading Buffer煮沸后點于膜上,干后封閉,孵一抗,二抗,顯色。PVDF膜熊樣如下:B、C。(白斑之間即為蛋白點樣點,由于膜被封閉液和5%BSA浸透而呈現這樣)


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C.jpg