TiBS:發表關于cryo-ET解析囊膜病毒結構的研究綜述

囊膜病毒

來源:清華大學 2021-09-14 08:38

  囊膜病毒門類眾多,其中不乏臭名昭著之輩,例如埃博拉病毒(Ebola),艾滋病病毒(HIV),流感病毒(influenza),以及新冠病毒等(SARS-CoV-2 virus)。研究其結構、入侵機制以及生命周期是針對性開發疫苗、抗體以及藥物的基礎,一直是結構生物學熱點。但囊膜病毒的多態性給傳統結構生物學手段帶來不少麻煩,其較小的尺寸(直

ET解析囊膜病毒結構的研究綜述

囊膜病毒門類眾多,其中不乏臭名昭著之輩,例如埃博拉病毒(Ebola),艾滋病病毒(HIV),流感病毒(influenza),以及新冠病毒等(SARS-CoV-2 virus)。研究其結構、入侵機制以及生命周期是針對性開發疫苗、抗體以及藥物的基礎,一直是結構生物學熱點。但囊膜病毒的多態性給傳統結構生物學手段帶來不少麻煩,其較小的尺寸(直徑~100nm)也給在細胞內直接觀察這些病毒的生命活動帶來了挑戰(圖1)?;仡欉^去20年來,cryo-ET技術與結構病毒學協同發展,相互促進:為在動態組裝、多形的囊膜病毒上直接解析高分辨蛋白結構,分子cryo-ET方向向高通量、高分辨方向發展;為一窺病毒在細胞中的生命活動,細胞cryo-ET方向新型特異性生物標記、冷凍光電聯合成像(cryo-CLEM)、冷凍聚焦離子束減?。╟ryo-FIB milling)等方向發展。2020年,cryo-ET為全面展示新冠病毒完整結構、組裝規律、病變細胞結構等方面做出了卓越的貢獻,已在頂尖刊物發表多篇文章,其中包括2020年9月李賽實驗室解析的完整新冠病毒三維結構。這些工作不僅為病毒學、疫苗、抗體研究提供了高分辨結構信息,也為科普、防疫等帶來大量真實準確的影像材料。

清華大學生命科學學院李賽副教授應邀在國際知名學術期刊Trends in Biochemical Sciences的冷凍電鏡特刊發表題為《囊膜病毒研究中的冷凍電鏡斷層成像技術》(Cryo-electron tomography of enveloped viruses)的綜述文章,系統總結了cryo-ET在解析囊膜病毒結構,揭示其組裝和生命周期機制等研究中的應用。文章也系統總結了近年來cryo-ET技術在各方面的提升及應用范圍的擴展,并對領域未來進行了展望。

蓬勃發展的cryo-ET技術及原位結構生物學

原位結構生物學的目標是將超大蛋白質機器從生物膜、病毒、細胞、甚至組織環境中直接解析,以獲得其在體結構、與核酸/生物膜的互作關系及分布信息。原位結構生物學核心技術是cryo-ET:它是將置于透射電鏡樣品臺上的冷凍樣品沿固定軸旋轉,并從多個角度拍照獲得傾轉系列(tilt series, TS),將其重構為三維斷層圖像,再使用子斷層平均法(sub-tomogram averaging, STA)進行結構解析的新型結構生物學方法。過去10年,為解決不同尺度的結構生物學問題,cryo-ET領域也開發出一系列樣品制備、蛋白定位、數據分析等配套技術,它們包括:快速投入式冷凍制樣、高壓冷凍制樣、冷凍光電聯合成像(cryo-CLEM)、電鏡可見的特異性生物標記、冷凍聚焦離子束減?。╟ryo-FIB milling)、相位板(VPP)、基于人工智能的圖像識別、降噪和圖形分割等?,F今,cryo-ET不再僅指采集傾轉系列數據的方法,而成為一種包納上述多種前沿技術的獨立的結構生物學方向。

相比傳統的冷凍電鏡方法,cryo-ET的原始數據增加了精確的Z軸信息,因此對樣品純度及組裝嚴格性要求較低,且在制備樣品過程中無需使其脫離原生環境,獲得的結構更具生理意義。隨著它的日益完善,從病毒到細菌、細胞甚至組織維度間的結構生物學空白將得到填補(圖2)。

Cryo-ET解析蛋白質復合物高分辨結構需要收集含有數萬個目標復合物的照片,因此,在細胞等原位環境中高效的尋找目標復合物是原位結構生物學的前提。然而,蛋白質復合物、病毒與細胞、組織之間存在巨大的尺寸差異,而且細胞內部環境極為擁擠、嘈雜,這給尋找目標復合物帶來了巨大挑戰。舉例說明,由于尺寸比例近似,在細胞中找到一顆病毒的難度好比在黃昏時滿是人群的足球場找到一顆足球。因此,僅使用冷凍電鏡在細胞中“碰運氣”式的尋找目標復合物將極為低效。目前有多種方案解決這個問題,目標均是在細胞中實現單分子的定位精度,它們可分為兩類:1)新型特異性生物標記;2)CLEM將光學顯微鏡與電鏡關聯。

Cryo-ET是揭示囊膜病毒結構、膜融合過程的利器

李賽在綜述中系統闡述了cryo-ET和STA如何作為囊膜病毒研究的有力工具。Cryo-ET技術不僅能重構病毒的完整結構組裝(圖1),還可提供組成病毒的各類結構蛋白的原位高分辨結構,如糖蛋白、基質蛋白等。其中病毒表面糖蛋白是病毒入侵細胞的關鍵分子、免疫防御的重要靶標,因而在結構蛋白研究中最受關注。Cryo-ET技術則提供了有關糖蛋白的多維度原位結構信息。例如,cryo-ET發現新冠病毒表面刺突蛋白可在病毒表面以一個較大的角度進行擺動;又如,丙型流感病毒表面糖蛋白HEF會在原位形成六聚的高聚結構,使得在原位上,HEF蛋白的頭部比晶體結構中有更多的旋轉和擴大(圖3)。這些原位結構的解析為疫苗、抗體的研發提供了病毒在天然狀態下的更多細節。