在結構研究和體外生物化學分析等很多實驗應用中都需要用到純化蛋白質。蛋白質可以從組織中獲取,亦或更經常的是從模式生物中過量表達獲得,如細菌、酵母或哺乳動物細胞培養等。蛋白質純化主要是根據它們各不相同的物理性質來從原料進行分離,其目的就是希望能浪費最少的雜蛋白,獲得最多的功能蛋白質。一個好的蛋白質的純化過程必須要將其純化工藝步驟優化至最少。

圖 1. 含Tris堿及其酸式物的Tris緩沖液溶液。Tris 25°C的pKa值是8.06,表示當pH=8.06,50%的Tris是質子化(酸式結構),50%是去質子化(堿式結構)。

本文主要評述了4種蛋白質純化中最常用的柱層析方法,并對它們各自的優缺點及存在的問題進行了討論。同時,本文還報道了來邦網(Labome)對98篇相關文獻的調研。調研結果表明,主要基于HIS、GST和FLAG標簽的親和層析和體積排阻層析是這些文獻中最常采用的方法。GE Healthcare是蛋白質純化研究中最大的試劑和儀器供應商。

建立蛋白質純化工藝

建立蛋白質純化工藝時,最重要的是需要考慮純化得到的蛋白質應能滿足其后續應用要求。蛋白質的數量及純度都必須滿足實驗分析要求。而且,因為后續研究需要的是保持良好折疊結構的活性蛋白質,因此蛋白質行為的相關信息也需要考慮。在純化及后續的保存過程中,很多處理方法都會對蛋白質的性質產生影響,如蛋白質的去折疊、聚集、降解和失活等。制定詳細計劃,在最短時間內完成蛋白質純化,并在最穩定的條件下進行保存才算是成功地完成了其整個純化過程。

圖 2. 用于蛋白質自動層析分離的Äktaprime plus系統。來自GE。

緩沖液體系

每一步純化過程中,蛋白質的溶液環境對其穩定性和活性的保持都非常關鍵。蛋白質應該保存在一個良好的緩沖液環境中,要避免突然的pH值變化,以其防止對蛋白質折疊狀態、溶解性和活性造成不可逆的影響。

緩沖液是一種含有共軛酸/堿對的水溶液。 緩沖液的pH值范圍根據其pKa值決定。該pKa值定義為50%的分子為酸式結構,50%為堿式結構時的pH值 (圖1)。關于緩沖液的一個常規原則是,其pH值應保證在pKa值左右1個pH值單位范圍內,從而保證其具有良好的緩沖能力。如此可以保證同時有足夠的以酸式結構和堿式結構存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 時可以將它們中和。這樣,緩沖液就可以防止pH變化導致的蛋白質穩定性改變。

圖 3. 用于聚組氨酸標簽蛋白質選擇性純化的Ni-NTA 配體共價連接交聯瓊脂糖介質。組氨酸殘基可代替結合的水分子與 Ni2+ 離子結合(如紅色箭頭所示),然后可以利用咪唑或游離組氨酸與 Ni2+ 離子的結合能力代替結合蛋白質,以達到將蛋白質洗脫的目的。來自BioKe。

一種好的緩沖液必須具有以下特征 [] :

水溶性

化學穩定性

在所需pH范圍內良好的緩沖能力

與分析和實驗應用條件具有良好的兼容性

與其他溶質具有良好的兼容性

很多物質都可以用于生物緩沖液。最常使用的緩沖液成分通常具有接近中性的pKa值,可在生理pH值范圍左右使用。表1列出了4種最常用的生物緩沖液、各自的pH值應用范圍及各自可能對蛋白質純化過程產生影響的優缺點。為保證足夠的緩沖能力,這些緩沖液的濃度通常為25mM。

緩沖液pH范圍優缺點
磷酸緩沖液   5.8-8.0  

pH值不隨溫度變化

便宜

紫外無吸收

不能與二價陽離子一起使用  
MOPS緩沖液   6.5-7.9  

不能高壓滅菌處理

pH值一定程度上隨溫度變化

在生理pH值范圍內具有高緩沖能力  
HEPES緩沖液   6.8-8.2  

不能高壓滅菌處理

pH一定程度上隨溫度變化

一定條件下會生成自由基 []  
Tris緩沖液   7.5-9.0  

pH值在一定程度上隨溫度或稀釋程度變化

便宜

會對部分酶活性造成影響 [], []

紫外無吸收  

表一: 蛋白質純化中最常用的生物緩沖液。緩沖液在一定pH值范圍內可保持它們的緩沖能力,部分緩沖液成分會對某些層析過程或者分析實驗造成影響??偨Y自Promega, Sigma-Aldrich, Applichem, Embl.de.

溶液添加劑