為保障食品安全,減少食源性疾病的發生,食源性致病菌的檢測顯得尤為關鍵。傳統的微生物檢驗方法主要基于培養法,一般流程為:樣品均質,增菌,選擇性分離,生化鑒定及血清學鑒定。其優點是靈敏度高、價格低廉、容易操作,缺點是勞動量大且檢驗周期長。隨著技術的發展,無需增菌,直接檢測食品樣品中低濃度的致病菌已成為可能。這些不依賴于培養、新型、快速的檢測技術可以有效分離、聚集和鑒別致病菌,從而縮減了整個檢驗周期。

 

  核酸檢測技術

 

  基于PCR的檢測技術

 

  普通PCR PCR技術被廣泛用于各類食品中致病菌及毒素的檢測。介于食品基質的影響,常需離心或磁珠法預處理將致病菌從食品中分離。也有研究使用金屬氫氧化物進行微生物的富集分離,Taylor等人使用氫氧化鈦從碎牛肉中分離E.coli O157:H7后,通過對志賀毒素基因II的擴增進行檢測。

 

  多重PCR多重PCR是在一個反應體系中使用多對引物同時進行多個目標擴增的PCR反應,可同時檢出多種病原微生物,比普通PCR更加高效、經濟、便捷。使用此技術,需要對多對引物進行精心設計,以使其具有相近的退火溫度。每對引物的濃度需要調整優化,否則可能導致引物二聚體生成和非目標片段擴增。

 

  實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR(qPCR)是利用熒光信號的變化,實時監測PCR反應過程中DNA擴增產物的方法。使用該方法,無需電泳或進行其他后續分析。最早的qPCR使用SYBR Green熒光染料進行熒光信號的測定,此外還有TaqMan探針法、分子信標法,他們在準確性、特異性方面要優于染料法。

 

  實時定量反轉錄PCR實時定量反轉錄PCR(RT-qPCR)也可實時監測擴增的目標產物,它先以RNA為模板反轉錄cDNA,再以cDNA為模板進行PCR反應。RT-qPCR靈敏度較高,樣品制備或擴增條件的細微差異都可能影響結果。由于RNA在胞外極易降解,故RT-qPCR優勢在于僅活細胞的RNA被提取,結果假陽性率較低。

 

  非PCR核酸檢測技術

 

  環介導等溫擴增環介導等溫擴增法(LAMP)是一種新穎的恒溫核酸擴增方法,其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物,利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(59-65℃)保溫30~60分鐘,即可完成擴增反應。與常規PCR相比,不需要模板的熱變性、溫度循環等過程,檢測成本低。LAMP特異性強、靈敏度高,其1小時內的擴增產物量可以高出普通PCR的103倍。

 

  核酸依賴性擴增檢測技術核酸依賴性擴增檢測技術(NASBA)是一項以RNA模板進行等溫核酸擴增并能實時監測結果的檢測方法。該技術的檢測反應有賴于AMV逆轉錄酶、噬菌體T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、兩種特別設計的特異性寡核苷酸引物和分子信標探針共同協作而完成。有研究者使用NASBA技術進行牛奶中金黃色葡萄球菌,檢出限分別為1~10cfu/mL。

 

  基因芯片基因芯片是一塊載有許多短小DNA探針的特殊玻璃片,探針與目標微生物的標記基因互補,大小在25~80bp之間。先提取目標微生物的DNA,進行熒光標記、變性后與芯片上的探針進行雜交,形成的雙鏈DNA釋放熒光信號,從而得到檢測。

 

  微流體芯片微流體技術是指在微觀尺寸下控制、操作和檢測復雜流體的技術,被稱為“芯片實驗室”或“微整合分析芯片”,可將樣品制備、生化反應、結果檢測等步驟集成到生物芯片上,實驗所用流體的量可低至納升或皮升級。Zhang等人使用微流體芯片檢測了面包、牛奶和香蕉中的鼠傷寒沙門氏菌等3種菌的檢測,檢測時間僅用了14min。

 

  免疫學方法

 

  酶聯免疫法ELISA酶聯免疫法ELISA是應用最廣泛的致病菌檢測方法之一。近期該方法的研究進展集中在如何提高抗體的密度以提高方法的靈敏度或新抗體的開發等。Chunglok等人使用單層的碳納米管作為抗固定化載體,檢測了牛奶中的鼠傷寒沙門氏菌,檢出限比其他免疫學方法低了2個log值。

 

  側向流免疫層析側向流層析技術以大孔徑的微孔濾膜為載體,先將特異性的抗原或抗體固定在濾膜上,樣品通過時發生特異性免疫反應,用免疫膠金體或免疫酶染色得到直觀的顯色結果。此技術的優點是成本低、穩定性好、技術難度小、檢驗時間短等,可用于高通量樣品篩選,但假陽性率比ELISA和PCR高。